Hoofdstuk 5:  Experimenten

5.1. Scheutcultuur

5.1.1. Initiatie op SIA-medium

5.1.1.1. Inleiding

In deze test werd nagegaan of de plant initieerbaar is op McCown woody plant medium, zoals de naam zelf aangeeft, wordt dit medium vaak gebruikt voor houtige gewassen.  Deze proef liep simultaan met de initiatieproef op SIB-medium.

5.1.1.2. Materiaal en methode

Na het afsnijden van de scheuten van de plant werden deze van alle bladeren ontdaan.  Hierbij werd de bladvoet en ongeveer 7 mm bladsteel aan de scheut gelaten.  Vervolgens werden deze scheuten in hun geheel gesteriliseerd (volgens het protocol beschreven in 4.2.1.) dit om zo weinig mogelijk verliezen te hebben.  De scheuten voor deze proef waren afkomstig van de 1 en 2- jarige zaailingen, van de oudere containerplanten en van takken en wortelopslag van adulte bomen.  Van de scheuten werden zoveel mogelijk gelijke explantaten gesneden met telkens 1 tot 2 knoppen per explantaat (Fig. 5.1.). 

Figuur 5.1. Links: explantaat waarvan de bladvoet is weggenomen

Rechts: Schets van een explantaat met bladvoet

De explantaten werden elk afzonderlijk in een proefbuis met 25 ml SIA-medium (samenstelling zie 4.5.2.) geplaatst.  In het totaal werden 40 explantaten op verschillende tijdstippen en van de verschillende soorten uitgangsmateriaal op deze wijze geïnitieerd.

5.1.1.3. Resultaat en bespreking

Het eerste wat opviel was dat alle explantaten na 1 week bruinzwart verkleurden, ook in het medium was een bruine waas van exudaten waarneembaar.  Al vlug was ook het opzwellen van de resterende bladvoet merkbaar.  Na de eerste initiatie van 10 explantaten werd dan ook beslist om bij verdere initiaties, de bladvoet volledig weg te nemen omdat deze anders het uitlopen van de knoppen zou kunnen belemmeren (Fig. 5.1.).  Van de 40 explantaten die op dat medium werden geïnitieerd gaven er uiteindelijk 2 aanleiding tot een nieuwe scheut.  Deze uitgroei werd ongeveer 13 dagen na de initiatie vastgesteld.  Door dit pover slaagpercentage, amper 5 %, werd dan ook beslist geen verdere proeven met dit medium meer te doen.

5.1.2. Initiatie op SIB-medium

5.1.2.1. Inleiding

In deze test werd nagegaan of de plant initieerbaar is op MS-medium (samenstelling zie 4.5.2.).  Deze proef liep simultaan met de voorgaande initiatieproef op SIA-medium.

5.1.2.2. Materiaal en methode

Na het afsnijden van de scheuten van de plant werden deze van alle bladeren ontdaan.  Hierbij werd de bladvoet en ongeveer 7 mm bladsteel aan de scheut gelaten.  Vervolgens werden deze scheuten in hun geheel gesteriliseerd (volgens het protocol beschreven in punt 4.2.1.) dit om zo weinig mogelijk verliezen te hebben.  De scheuten voor deze proef waren afkomstig van de 1 en 2- jarige zaailingen, van de oudere containerplanten en van takken en wortelopslag van adulte bomen.  Van de scheuten werden zoveel mogelijk gelijke explantaten gesneden met telkens 1 tot 2 knoppen per explantaat.  De explantaten werden elk afzonderlijk in een proefbuis met 25 ml SIB-medium (samenstelling zie 4.5.2.) geplaatst.  In het totaal werden 224 explantaten op verschillende tijdstippen en van de verschillende soorten uitgangsmateriaal op deze wijze geïnitieerd.

5.1.2.3. Resultaat en bespreking

Het eerste wat ook hier opviel was de bruinzwart verkleuring van de explantaten.  De bruine waas van exudaten in het medium bleef echter uit.  Ook hier was ook het opzwellen van de resterende bladvoet (Fig. 5.2.) merkbaar en werd dan ook na de eerste initiatie van 10 explantaten, bij de verdere initiatie de bladvoet volledig weggenomen.

Figuur 5.2. Explantaat met opgezwollen bladvoet op SIB-medium

Van alle explantaten die op dit medium werden geïnitieerd groeiden 73 knoppen uit tot een nieuwe scheut, wat gelijk is met een slaagkans van 33 %.  Een mogelijke verklaring voor dit laag cijfer is waarschijnlijk dat de knop bij de minste beschadiging, bij het wegnemen van de bladvoet, niet meer uitloopt.  Ook dient gezegd dat naarmate de techniek verbeterde om de bladvoet weg te nemen, zonder hierbij de knop te beschadigen, de kans dat de knop uitloopt stijgt tot ongeveer 60 %.  Gemiddeld gezien liepen de meeste scheuten uit tussen de 7^de en de 12^de dag na de initiatie.  De vlugste scheut liep uit na 5 dagen maar er waren ook scheuten die pas een maand na initiëren uitliepen.  De explantaten met een eindknop reageerden veel trager dan deze zonder eindknop.

5.1.3. Steriliteittest

5.1.3.1. Inleiding

Deze test werd uitgevoerd met een tweetal explantaten om te bepalen of in deze plant al dan niet latente bacteriën aanwezig zijn.

5.1.3.2. Materiaal en methode

Deze test werd uitgevoerd op een vloeibaar “peptone yeast glucose” medium (PYG) (Cornu en Michel, 1987) .  Dit medium bestond uit 1000ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 5 g Difco peptone, 5 g Difco gist extract en 5 g glucose.  Een tweetal explantaten die succesvol geïnitieerd waren werden elk afzonderlijk in een testtube met dit PYG-medium geïncubeerd.  Een week later werd gekeken of dit medium nog helder of troebel (gecontamineerd) was.

5.1.3.3. Resultaat en bespreking

Geen enkel buisje was gecontamineerd.  Hoewel maar één bacterieel testmedium gebruikt werd, hadden we dus aanwijzingen dat in verdere proeven niet gevreesd hoeft te worden dat de cultuur verloren zou gaan aan latente besmettingen.  Helemaal zeker is dit echter niet want bepaalde bacteriën, mycoplasma, spiroplasma en rickettsia groeien niet op media.

5.1.4. Propagatie proef 1

5.1.4.1. Inleiding

In deze test werd voor een eerste maal nagegaan hoe de plant op de verschillende cytokininen reageert.  De proef werd zo opgesteld dat drie cytokininen naast elkaar konden vergeleken worden.  Cytokininen B en D zijn krachtige nieuwe BA-derivaten die bij een aantal gevallen superieur bleken te zijn aan BA (mondelinge mededeling I. Bogaert).  Omdat uit een proef bij enkele Annona species bleek dat de propagatie het beste verliep op een MS-medium met 2 µM Kinetine en 8 µM BA (Rasai et al., 1995) werd ook hier het gebruik van beide cytokininen toegepast.

5.1.4.2. Materiaal en methode

Er werd gebruik gemaakt van het AAT-medium (samenstelling zie 4.5.2.) aangevuld met 2 µM kinetine en 8 µM BA, cytokinine B of cytokinine D.  In één bokaal werden alle explantaten samen gezet die van eenzelfde scheut gesneden werden.  De volledige bladvoet werd weggenomen.  De in vitro gevormde scheut werd op 1 tot 2 mm van het oorspronkelijke explantaat afgesneden en dit oorspronkelijke explantaat werd ook verder gebruikt.  Elke 3 tot 4 weken werden de explantaten overgeënt op vers medium.  De eindevaluatie van deze proef gebeurde na 2 maanden.

5.1.4.3. Resultaat en bespreking

Het oorspronkelijke explantaat kan opnieuw uitlopen indien men enkele mm van de scheut laat staan (Fig. 5.3).  Ook op de in vivo plant zorgt deze snijwijze op een versnelde uitgroei van nieuwe scheuten.

Figuur 5.3. Scheutvorming op oorspronkelijk explantaat

Bij tussentijdse evaluaties kon worden vastgesteld dat de scheuten op BA en cytokinine D veel beter uitliepen dan deze op cytokinine B.  Tijdens de twee maanden bleken de scheuten tekenen van winterrust te vertonen.  Waar de groei tijdens de initiatie zeker 1,5 cm per maand bedroeg werd nu slechts een groeisnelheid van 0,3 cm per maand gehaald.

Uit deze proef kon besloten worden dat BA de meeste scheuten leverde.  Cytokinine D scoorde ook goed maar gaf toch iets minder scheuten dan BA (Fig. 5.4.).

Figuur 5.4. procentuele uitgroei van scheuten

5.1.5. Propagatie proef 2

5.1.5.1. Inleiding

Nu duidelijk was dat de planten last hadden van winterrust werd een proef opgesteld om te proberen de neiging van de plant om in winterrust te gaan te breken en de scheuten weer volop te laten groeien.  Door het combineren van het auxine NAA met de cytokininen hoopten we de celdeling te stimuleren.  Elke 3 tot 4 weken werden de explantaten overgeënt op vers medium.  De eindevaluatie van deze proef gebeurde na 2 maanden.

5.1.5.2. Materiaal en methode

Er werd gebruik gemaakt van het AAT-medium (samenstelling zie 4.5.2.) aangevuld met 2 µM kinetine, en 8 µM BA, cytokinine B of cytokinine D.  Bij de helft van de bokalen van elke behandeling werd 3 µM NAA toegevoegd.  De integrale explantaten van de vorige proef werden zoveel mogelijk op het medium met hetzelfde cytokinine geplaatst.  De explantaten die tijdens de vorige test op BA stonden werden terug op BA gezet en zo ook met deze van cytokinine B en D.

5.1.5.3. Resultaat en bespreking

Na twee maanden werd bij de evaluatie vastgesteld dat er geen opmerkelijk verschil was in groei tussen de behandelde bokalen met 3 µM NAA ten opzichte van de niet behandelde bokalen (Fig. 5.5.).  Wat de scheutvorming betreft zien we een licht pecentuele stijging bij cytokinin B en D.  We merken wel op dat ook hier cytokinine D het iets slechter doet dan BA.  Merk op dat deze proef te klein is uitgevoerd om hier te besluiten dat NAA de scheutvorming al dan niet positief bevordert.

Figuur 5.5. Procentuele scheutvorming

5.1.6. Propagatie proef 3

5.1.6.1.Inleiding

Een tweede proef met het oog op een betere groei en hogere scheutvorming bestond erin de concentratie van de aanwezige cytokininen op te drijven.  Omdat in de vorige proef geen echte verbetering door de aanwezigheid van NAA werd opgemerkt, werd er besloten in deze test geen NAA meer toe te voegen.  Elke 3 tot 4 weken werden de explantaten overgeënt op vers medium.  De eindevaluatie van deze proef gebeurde na 2 maanden.

5.1.6.2.Materiaal en methode

Er werd gebruik gemaakt van het AAT-medium (samenstelling zie 4.5.2.).  Bij de ene helft werd 2 µM kinetine, en 8 µM BA, cytokinine B of cytokinine D toegevoegd.  Bij de andere helft van de bokalen 3µM kinetine en 12 µM BA, cytokinine B of cytokinine D.  Ook hier werden de explantaten zoveel mogelijk op hetzelfde medium gezet.  Hierbij kwamen enkel de explantaten die in de vorige proef op het medium met NAA stonden nu op de verhoogde concentratie te staan.

5.1.6.3.Resultaat en bespreking

Het eerste wat opviel bij alle drie de behandelingen is dat bij de verhoogde concentraties ook een verhoging van het aantal scheuten vast te stellen is (Fig.5.6.).  Deze stijging is het opmerkelijkst bij cytokinine B met een stijging van ongeveer
50 %.

Figuur 5.6. Procentuele scheutvorming

Weliswaar blijft het resultaat met cytokinine B ver onder dat van BA en cytokinine D.

Ook hier weer blijkt BA als beste uit de bus te komen ware het niet dat de scheuten bekomen op cytokinine D een minder hydrisch uitzicht en een gezondere lichtgroene kleur hebben (Fig. 5.7.).

Figuur 5.7. Links cytokinine D en rechts BA

5.2. Bladcultuur

5.2.1. Organogenese op AAT-medium proef 1

5.2.1.1. Inleiding

De bedoeling van deze proef was om na te gaan of ook zoals bij Annona squamosa scheutvorming op bladexplantaten mogelijk is (Nair et al., 1984).

5.2.1.2. Materiaal en methoden

De bladeren die gebruikt werden voor deze proef waren afkomstig van de scheuten van de in vivo planten, die gebruikt werden voor de hiervoor beschreven initiatieproeven.  Deze bladeren werden eerst volgens het protocol (beschreven onder punt 4.2.1.) gesteriliseerd.  Hierna werden ze versneden in stukken met een grootte variërend van 0,5 tot 2,5 cm².  Omdat de scheuten bij de meeste plantensoorten ontstaan aan de hoofdnerven werd zo gesneden dat in de meerderheid van de stukken een nerf liep.

De explantaten werden telkens met de onderzijde naar boven gelegd zodat de huidmondjes vrij konden ademen.

Het eerste callusinducerend medium was AAT-medium aangevuld met 2 µM TDZ en 2 µM 2,4D.  Het tweede callusinducerend medium was terug AAT-medium maar deze keer aangevuld met 5 µM cytokinine D en 2 µM 2,4D.  Het eerste scheutinducerend medium was AAT-medium aangevuld met 4 µM TDZ en 1 µM NAA.  Het tweede scheutinducerend medium was AAT-medium aangevuld met 10 µM TDZ en 1 µM NAA.  Elke 2 weken werden de explantaten op vers medium geplaatst.  Het overzetten van de explantaten van het callusinducerend naar het scheutinducerend medium gebeurde na 1 maand.  De eindevaluatie gebeurde na 2 maanden.

5.2.1.3. Resultaat en bespreking

Het eerste probleem stelde zich bij de sterilisatie van de bladeren.  Toen deze na 15 minuten steriliseren en na naspoelen versneden werden begonnen deze reeds zwart te verkleuren, wat duidelijk geen goed voorteken was.  Hierdoor werd beslist bij verdere proeven de sterilisatieduur van de bladeren in te perken tot 10 minuten.  Normaal gezien worden de explantaten na 1 tot 2 weken reeds overgezet op het scheutinducerende medium.  Omdat hier na twee weken voor beide media nog niets van callus zichtbaar was werd besloten nog eens op het callusinducerende medium over te enten.  Toen na deze tweede periode van twee weken op het callusinducerend medium nog steeds geen callus zichtbaar was en de bruinverkleuring van de explantaten zich verder zette werd beslist toch over te gaan naar het scheutinducerend medium (Fig. 5.8.).

Figuur 5.8. Verregaande zwartverkleuring

Hierbij werd van ongeveer de helft van de explantaten de zwart verkleurde delen weggesneden.  Toen bij de eerste evaluatie na twee weken voor beide media nog geen scheutvorming werd vastgesteld werd beslist de explantaten nog eens voor twee weken over te enten op hetzelfde medium.  Ook na deze bijkomende periode van twee weken werd geen scheutgroei vast gesteld op beide media.

5.2.2. Organogenese op AAT-medium proef 2

5.2.2.1. Inleiding

Door de slechte resultaten van de eerste proef werd beslist deze proef nog een tweede maal over te doen.

5.2.2.2. Materiaal en methoden

De bladeren die gebruikt werden voor deze proef waren afkomstig van de scheuten van de in vivo planten, die gebruikt werden voor de hiervoor beschreven initiatieproeven.  Deze bladeren werden eerst volgens het protocol (beschreven onder punt 4.2.1.) gesteriliseerd.  Omdat bij de vorige proef bleek dat de bladeren de sterilisatie van 15 minuten amper overleefden werd hier slecht gedurende 13 minuten gesteriliseerd.  Voor deze proef werd ook gebruik gemaakt van bladeren verkregen van de reeds succesvol geïnitieerde scheuten.  Doordat deze in vitro gevormd zijn is sterilisatie van deze bladeren niet nodig.  De bladeren werden ook hier versneden tot explantaten van verschillende grootte en terug met de onderzijde naar boven op het medium gelegd.

Dezelfde vier media werden gebruikt als in de voorgaande proef.

Deze keer werd er beslist om ongeacht of er callus gevormd werd na twee weken over te enten op het scheutinducerend medium.  Elke twee weken werden de explantaten overgeënt op vers medium.  De eindevaluatie gebeurde na anderhalve maand.

5.2.3.3. Resultaat en bespreking

Ondanks het inkorten van de sterilisatietijd met twee minuten werd ook hier voor de initiatie reeds zwartverkleuring van het blad vastgesteld.

Na twee weken was ook hier geen enkele callusgoei op geen van beide media waarneembaar.  Omdat vooraf beslist was om na maximaal twee weken over te stappen op het scheutinducerend medium werden de explantaten nu overgeënt.  Ook hier werden bij ongeveer de helft van de explantaten de zwartverkleuring weggesneden.

Er werd ook een lichte zwartverkleuring op de explantaten afkomstig van de in vitro bladeren vastgesteld, al was deze wel beperkt tot de rand en de bladvoet (Fig. 5.9.). Er mag dus besloten worden dat de sterilisatietijd nog te lang is en dat in vitro bladeren het beste uitgangsmateriaal zijn voor verdere proeven.

Figuur 5.9. Lichte zwartverkleuring bij explantaten afkomstig uit in vitro

Na twee weken op dit medium was bij geen van beide media scheutvorming waarneembaar.  Toen ook na vier weken nog geen scheutgroei te zien was werd besloten dat beide media niet voldeden om scheuten op het blad te initiëren.

5.2.3. Organogenese op BI-medium

5.2.3.1. Inleiding

Naar aanleiding van de proeven uitgevoerd in 1984 door Nair et al. met bladeren van Annona squamosa werd beslist een proef op te zetten met het medium dat als beste uit die proef kwam (Nair et al., 1984).  Volgens Nair et al. is het niet nodig om de explantaten eerst gedurende één tot twee weken op een callusinducerend medium te brengen.  Voor deze proef besloten we dan ook deze werkwijze te volgen.  Omdat de in vivo planten in winterrust gingen kon deze proef slechts één maal worden uitgevoerd.

5.2.3.2. Materiaal en methode

De explantaten voor deze proef werden verkregen uit de bladeren van de laatste in vivo scheuten die geïnitieerd werden.  Door de zware zwartverkleuring van de bladeren na sterilisatie en doordat het inkorten van de tijd met 2 minuten geen stijging van het aantal besmettingen teweegbracht, werd beslist om nu slechts 10 minuten te steriliseren, dit om de zwartverkleuring tot een minimum te beperken.

Ook hier werden de bladeren versneden tot explantaten van verschillende grootte en met de onderzijde naar boven op het medium geplaatst.

Het gebruikte BI-medium werd voor de scheutinductie met 9 µM BA en 2 µM kinetine aangevuld.  Elke twee weken werden de explantaten overgeënt op vers medium.  De eindevaluatie gebeurde na anderhalve maand.

5.2.3.3. Resultaat en bespreking

Door de sterilisatietijd te beperken tot 10 minuten was de zwartverkleuring van de bladeren vóór de initiatie minimaal.  Echter door een kortere sterilisatieduur te nemen moest na één week reeds 70 % van de petriplaten worden vernietigd omdat deze gecontamineerd waren. 

Wel konden we vaststellen dat de zwartverkleuring van de explantaten op de overgebleven platen veel minder was dan bij de vorige proeven (Fig. 5.10.).

Figuur 5.10. Explantaten op BI-medium na 6 weken

Bij geen enkel van de overgebleven platen werd scheutgroei vastgesteld.  Op de vraag of dit te wijten is aan het feit dat er geen callusinducerend medium gebruikt werd of omdat het medium niet voldoet aan de noden van Asimina triloba kan geen definitief antwoord worden gegeven omdat de proef niet kon herhaald worden bij gebrek aan bladeren.

Om verdere proeven met bladmateriaal op te starten kan er beter geïnitieerd worden in proefbuizen om zo contaminatie in te perken.  Er mag wel gesteld worden dat callusvorming zelfs bij hoge concentraties niet evident is.

5.3. Zaadcultuur

5.3.1. Zaaien in vitro

5.3.1.1. Inleiding

In deze proef werd nagegaan onder welke omstandigheden de zaden van Asimina triloba op medium kiemen.  Deze zaaiproef werd drie maal uitgevoerd.  De eerste maal hadden de zaden nog geen echte stratificatie gekregen.  De tweede maal hadden de zaden vier maand doorgebracht in de koelkast en de laatste maal hadden de zaden een volledige stratificatie achter de rug.

5.3.1.2. Materiaal en methode

Voor deze proef werden telkens 12 zaden gebruikt.  Na sterilisatie werden van zes zaden in de zaadhuid inkepingen gemaakt om de opname van water uit het medium te bevorderen.

Er werd in plaats van 25 ml in de proefbuizen 35ml medium gebruikt.  Het AAT-medium werd aangevuld met 3 µM GA₃ om die kiemrust te breken.

De proef bestond uit vier reeksen van elk drie zaden.  De eerste reeks waren zaden zonder inkepingen en de proefbuizen werden niet afgeschermd.  De tweede reeks werd ook niet afgeschermd maar hier werden zaden met inkepingen gebruikt.  Bij de derde en vierde reeks werden de proefbuizen in aluminiumfolie gewikkeld zodat de zaden zonder licht konden kiemen.  In de derde reeks werden terug zaden zonder en in de vierde reeks zaden met inkepingen gebruikt.  Elke week werd gecontroleerd of er zaden gekiemd waren.  De eindevaluatie gebeurde na 2,5 maanden.

5.3.1.3. Resultaat en bespreking

Bij geen enkel van de 36 zaden werd kieming vastgesteld.  Wel werd vastgesteld bij de tweede poging dat de zaadhuid niet helemaal gesloten is.  Hierdoor is het mogelijk dat de javel tijdens het steriliseren in de zaadhuid raakt en het embryo afdoodt.  Om dit tegen te gaan werd bij de laatste uitvoering de sterilisatieduur ingekort tot 12 minuten.  Het gevolg hiervan was dat 80 % van de zaden onvoldoende steriel bleken.  Bij nadere inspectie van de beschimmelde zaden bleek dat de schimmel zich ook binnen in de zaadhuid had ontwikkeld bij de zaden zonder inkeping in de zaadhuid.  Bij de zaden die werden opengesneden werd nergens een embryo teruggevonden (Fig. 5.11.).  Verder is een mogelijke verklaring voor het feit dat er geen kieming optrad dat aan de koudebehoefte voor zaden niet voldaan werd.

Figuur 5.11. Boven: overlangse doorsnede van het zaad ontdaan van de zaadhuid

Onder: schematische doorsnede van het zaad

5.3.2. Embryogenese

5.3.2.1. Inleiding

Omdat het embryo in geen enkel van de zaden terug te vinden was werd beslist om het zaad te versnijden tot explantaten en volledig, met uitzondering van de zaadhuid, op het callusinducerend medium te brengen.  Deze proef werd drie maal uitgevoerd.  De eerste maal hadden de zaden nog geen echte stratificatie gekregen.  De tweede maal hadden de zaden vier maand doorgebracht in de koelkast en de laatste maal hadden de zaden een volledige stratificatie achter de rug.

5.3.2.2. Materiaal en methode

Voor de callusinductie werd het ZI-medium aangevuld met 2 µM BA en 10 µM 2,4D.  Na een week werden de explantaten overgeënt op ZI-medium aangevuld met 10 µM BA en 5 µM NAA.

Deze proef werd telkens met twee zaden uitgevoerd.  Om de minste kans te lopen dat het embryo door de javel aangetast zou worden werd de sterilisatie tot 10 minuten beperkt.  Na elke manipulatie werd van pincet gewisseld om de kans op contaminatie nog meer te beperken.  De petriplaten werden in aluminiumfolie gewikkeld om ze af te schermen van het licht.  Elke week werd gekeken naar eventuele groei. Na twee weken werden de explantaten overgeplaatst op het tweede medium.  De eindevaluatie gebeurde na anderhalve maand.

5.3.2.3. Resultaat en bespreking

Bij geen enkel van de zes zaden werd embryogenese vastgesteld (Fig. 5.12.).  Ook hier kan dit te wijten zijn aan meerdere oorzaken.  Een onvoldoende aangepast medium en onvoldoende gestratificieerde zaden zijn maar twee van de mogelijkheden.

Figuur 5.12. foto van bij de eindevaluatie