Hoofdstuk 4:  Algemene materialen en methoden

4.1. Uitgangsmateriaal

Voor de vermeerdering van Asimina triloba werd gebruik gemaakt van geselecteerde en geënte planten verkregen van Dhr. Hedwig Scheer en via ir. Antoine Vermeir.  Via Prof. Goetghebeur en Dhr Marc Libert werden ook 1- en 2-jarige zaailingen, takken, wortelopslag, alsook zaden verkregen.

4.2. Sterilisatie

4.2.1. Protocol

Het te steriliseren materiaal (bladeren, scheuten, zaden,…) wordt gedurende 10 seconden gespoeld met een 70% ethanol, dit om luchtbelletjes te verwijderen.  Na het afgieten van de ethanol wordt 10% javel en enkele druppels detergent (Tween 80), als uitvloeier, toegevoegd.  De bokaal wordt na goed schudden gedurende 15 minuten ondersteboven gezet om alles goed te steriliseren.  De oplossing wordt afgegoten en het materiaal wordt drie maal nagespoeld met steriel water.

4.2.2. Papier

Steriel papier wordt verkregen door het dubbel verpakt in aluminiumfolie gedurende 3 tot 4 uur te verwarmen in een oven op 180 °C.  Eenmaal steriel kan het voor gebruik in de flowkast uit de folie gehaald worden met steriele pincetten.

4.2.3. Instrumenten

Voor het steriliseren van pincetten en scalpels wordt gebruik gemaakt van een parelsterilisator die zich in de flowkast bevindt.  Deze heeft een werkingstemperatuur van 250 °C.

4.3. Recipiënten

4.3.1. Scheutcultuur

Tijdens de initiatie werd gebruik gemaakt van glazen proefbuizen met een inhoud van 55 ml en bijhorend dopje.  Latere culturen werden in een meli-bokaal met een inhoud van ± 380 ml en bijhorend transparant schroefdeksel geplaatst.  Alle bokalen zijn voorzien van een klein gleufje in de bovenste rand om een betere gasuitwisseling te bekomen met de omgeving (De Proft. et al. 1985).

4.3.2. Bladcultuur

Alle proeven i.v.m. de bladcultuur van Asimina triloba werden uitgevoerd in steriele petriplaten met een hoogte van 16 mm en een diameter van 90 mm die afgesloten werden met polyethyleenfolie.

4.3.3. Zaadcultuur

Voor de zaadculuur werd gebruik gemaakt van petriplaten en van proefbuizen met een inhoud van 55 ml en bijhorend dopje.

4.3.4. Medium

Tijdens de proeven werden de recipiënten gevuld met gestandaardiseerde hoeveelheden medium.  Voor de proefbuizen en de petriplaten was dit 25 ml en voor de meli-bokalen 100 ml.

4.4. Groeikamer

Alle plantenmateriaal werd onder algemene condities geplaatst met een lichtregime van van 16 uur licht/8 uur donker met een lichtintensiteit van 40 μmol m^-²s^-1 PAR en bij een temperatuur van 22 tot 23 °C.

4.5. Media

4.5.1. Algemeen

Om eenvoudig een medium te kunnen aanpassen wordt uitgegaan van een basismedium en stockoplossingen.  De stockoplossingen worden in de diepvries bewaard bij –18 °C om contaminatie en verval van de actieve component af te remmen.  Een stockoplossing wordt verkregen door de actieve component in poedervorm op te lossen in een oplosmiddel geschikt voor die stof.  De concentratie wordt op 1 mg/ml of op 10 mg/ml genomen afhankelijk van de stof.

Alle componenten worden samengevoegd in een inox kookpot met uitzondering van de agar en de thermolabiele stoffen.  Na menging wordt de pH ingesteld m.b.v. KOH of HCl.  Het mengsel wordt aan de kook gebracht en al roerend wordt de agar toegevoegd.  Het medium wordt over de recipiënten verdeeld en geautoklaveerd.

4.5.2. Gebruikte media

Scheut initiatie medium A (SIA-medium):

Het medium bestond uit 1000 ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 30 g sucrose, 7 g agar MC 29, 4,924 g McCown Woody Plant Medium (Lloyd and McCown, 1980) macro+micro+vitaminen (Duchefa).  De pH werd, voor het autoklaveren, ingesteld op 5,8.

Scheut initiatie medium B (SIB-medium):

Het medium bestond uit 1000 ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 30 g sucrose, 200 mg sequestreen, 7 g agar MC 29, 4,405 g Murashige & Skoog (Murashige en Skoog, 1962) macro+micro+vitaminen (Duchefa).  De pH werd, voor het autoklaveren, ingesteld op 5,8.

Algemeen Asimina triloba medium (AAT-medium):

Het medium bestond uit 1000 ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 30 g sucrose, 200 mg sequestreen, 7 g agar MC 29, 4,405 g Murashige & Skoog (1962) macro+micro+vitaminen (Duchefa), 0,1 mg Ca-panthothenaat, 0,1 mg biotine.  De pH werd, voor het autoklaveren, ingesteld op 5,8.

Blad initiatie medium (BI-medium):

Het medium bestond uit 1000 ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 30 g sucrose, 7 g agar MC 29, 4,405 g Murashige & Skoog (1962) macro+micro+vitaminen (Duchefa).  De pH werd, voor het autoklaveren, ingesteld op 5,8.

Zaad initiatie medium (ZI-medium)

Het medium bestond uit 1000 ml gedestilleerd water (na verdampingsverliezen), 40 g sucrose, 20 g glucose, 1,8 g gelrite, 4,405 g Murashige & Skoog (1962) macro+micro+vitaminen (Duchefa).  De pH werd, voor het autoklaveren, ingesteld op 5,8.

4.6. Autoklaveren

Het autoklaveren gebeurde, m.b.v. een verticale autoclaaf, bij 121°C en 1 atm. overdruk gedurende 15 minuten.

4.7. De plantengroeiregulatoren

Tijdens de proeven werd gebruik gemaakt van verschillende plantengroeiregulatoren.  Hier volgt een overzicht met telkens de structuurformule en de molecuulmassa.

4.7.1. Auxines

4.7.1.1. 2,4-dichlorophenoxy-azijnzuur (2,4-D)

Figuur 4.1. Structuurformule van 2,4D

MM = 221 g/mol

4.7.1.2. 1-naftylazijnzuur (NAA)

Figuur 4.2. Structuurformule van NAA

MM = 186,2 g/mol

4.7.2. Cytokininen

4.7.2.1. Benzyladenine (BA)

Figuur 4.3. Structuurformule van BA

MM = 225,3 g/mol

4.7.2.2. Kinetine (Kin)

Figuur 4.4. Structuurformule van Kin

MM = 215,2 g/mol

4.7.2.3. Thidiazuron (TDZ)

Figuur 4.5. Structuurformule van TDZ

MM = 220,2 g/mol

4.7.2.4. Cytokinine B en D

De cytokininen B en D zijn krachtige nieuwe BA-derivaten die bij een aantal gevallen superieur bleken te zijn aan BA (mondelinge mededeling I. Bogaert).  Omwille van de vertrouwelijkheid wordt hun structuurformule en molecuulmassa hier niet weergegeven.

4.7.3. Gibberellinen

4.7.3.1. Gibberellinezuur (GA₃)

Figuur 4.6. Structuurformule van GA₃

MM = 346,4 g/mol