Hoofdstuk 2:  Plantengroeiregulatoren

2.1. Inleiding

Het idee dat plantendelen elkaar beïnvloeden is niet nieuw.  Reeds in 1758 concludeerde Duhamel du Monceau na zijn experimenten bij bomen dat de neerwaartse sapstroom de gezondheid van de wortels beïnvloeden.  Deze bewering hield stand tot 1880.  Julius von Sachs beperkte de theorie door te bewijzen dat de plant orgaanvormende stoffen maakt, deze verplaatst naar verschillende delen van de plant en daar de groei en ontwikkeling sturen.  Van deze stoffen werd verondersteld dat ze worden aangemaakt als gevolg van uitwendige stimuli.  De basis voor de moderne visie en huidig onderzoek werd in 1880 gegeven door Charles Darwin in zijn boek “The power of movement in plants” waarin hij de resultaten i.v.m. de groeirichting van graskiemplantjes in het licht weergaf.  Het eerste grote bewijs werd geleverd in 1926 toen Fritz Went als eerste een substantie isoleerde uit de toppen van grasplanten.  Deze substantie werd in 1931 auxine genoemd door Kogl en Haagen-Smit naar het Griekse auxein wat doen stijgen betekent.  Door het pionierswerk van Went werden vele wetenschappers aangespoord om op zoek te gaan naar andere plantengroeiregulatoren.  De aanzet naar de ontdekking van de cytokininen werd door Haberlandt gegeven in 1913 door de zoektocht naar de chemische controle in de celdeling.  De uiteindelijke ontdekking gebeurde begin de jaren ’40 toen men kokosmelk aan het medium toevoegde in een poging haploïde embryo’s te laten groeien.  Aangezien dit niet lukte zonder de kokosmelk was het nu geweten dat er in die melk een stof zit die voor de groei van het embryo zorgt.  Na heel wat testen van verschillende componenten aanwezig in de kokosmelk vond het team van Skoog een adenine verbinding die de celdeling stimuleert in de aanwezigheid van auxine.  De stof kreeg de naam kinetine door zijn invloed op activatie van de celdeling (“cytokinesis”).  Na deze ontdekking startte men met de zoektocht naar analogen.

In 1963 vond men reeds zeatine in Zea mays.  Een verwante met deze stof, het isopentenyladenine, werd in alle reeds onderzochte planten aangetroffen.

Nog andere onderzoeken lagen aan de basis van nog andere plantengroeiregulatoren: pogingen om bladval en winterrust te beheersen leiden tot abscisinezuur, de ontdekking van ethyleen kwam na een studie naar het effect van belichtingsgassen en rook, onderzoek naar het ontstaan van plantenziekten zorgde voor de ontdekking van gibberellinen.

In de loop van de jaren werden reeds heel wat analogen ontwikkeld.  Deze kennen heel wat toepassingen in land- en tuinbouw daar waar men invloed wil hebben over bepaalde plantenprocessen.  Zo kan men de bloei, rijping, groei en bladval bevorderen.  Het zijn echter de weefselculturen die het potentieel van de plantengroeiregulatoren onthullen (Skoog en Miller, 1957).

Er zijn twee redenen waarom er tot op heden nog zo weinig gekend is over de werkingsmechanismen van plantengroeiregulatoren.  Ten eerste is er het feit dat men niet wil erkennen dat de plantenontwikkeling iets uniek is.  Ten tweede denkt men dat het concept van de groeiregulatoren hetzelfde is als dat van de dierlijke hormonen (Trewavas, 1981).  Hierdoor leiden vele van de huidige onderzoeken tot contradicties.  Sinds men de splitsing van de meercelligen in een groep van plantaardige en een groep van dierlijke organismen heeft doorgevoerd, is er geen enkele reden meer om te veronderstellen dat de hormoonmechanismen bij de beide groepen gelijk zijn.  Alleen al het verschil tussen de totipotente plantencel en de verregaande specialisatie van een dierlijke cel toont aan hoe groot de verschillen tussen beide groepen zijn.  Toch stammen alle concepten met betrekking tot de plantengroeiregulatoren af van de terminologie van de dierlijke mechanismen.  Trewavas vroeg zich in 1981 al af waarom men dan tot op heden verwonderd is dat er nog steeds zo weinig geweten is over de mechanismen van de plantengroeiregulatoren.

2.2. Cytokininen

2.2.1. Inleiding

In 1913 ontdekte Gottlieb Haberlandt dat een component uit het floeem in staat is om celdeling te stimuleren.  Johannes van Overbeek zag in 1971 dat het melkachtige endosperm van kokosnoten dezelfde eigenschap bezit.  Hij toonde ook aan dat verschillende planten ook componenten bezitten die de celdeling stimuleerden.  In 1954 bewezen Jablonski en Skoog in een uitbreiding op het werk van Haberlandt dat de componenten die de celdeling stimuleren te vinden zijn in het vasculair weefsel.  De eerste keer dat een cytokinine geïsoleerd werd was in 1955 door Miller en dit uit haring sperma.  Deze component werd kinetine genoemd omdat het de celdeling (cytokinesis) kan beïnvloeden.  In 1955 beschreven Hall en deRopp dat kinetine kan verkregen worden uit DNA degradatie producten.  Het eerste natuurlijk voorkomende cytokinine werd door Miller, ongeveer gelijktijdig met Letham, geïsoleerd uit Zea mays in 1961.  Sindsdien zijn reeds vele natuurlijk voorkomende cytokininen geïsoleerd en deze component is alomtegenwoordig in alle plantensoorten.

De meeste cytokininen zijn adeninemoleculen (Jacobs, 1979).  Thidiazuron (TDZ) en de aanverwante moleculen vormen hierop een uitzondering.  De adeninebevattende cytokininen kunnen in twee gerelateerde groepen worden ingedeeld die overlappen in spectra en biologische activiteiten.  Een eerste groep is die van de isoprenoïdecytokininen, deze bevat zeatine, dihydrozeatine en isopentenyladenine en hun verschillende derivaten.  De tweede groep is deze van de aromatische-cytokininen.  Alle cytokininen van deze groep bezitten een ringstructuur.  BA en zijn derivaten: meta-topoline, ortho-topoline en de nieuwe cytokininen B en D behoren tot deze laatste groep.

2.2.2. Biosynthese en metabolisme

De cytokinine concentraties zijn meestal het hoogst in de meristematische zones en de groeiende weefsels van de plant.  Momenteel wordt alom aangenomen dat ze worden gesynthetiseerd in de wortels en via het xyleem getransporteerd worden naar de scheuten.  De cytokinine biosynthese gebeurt via een biochemische modificatie van adenine.  Het synthese proces bestaat uit 4 stappen:

isopentyl pyrofosfaat, een product van de “mevalonate” pathway wordt geïsomeriseerd.

Dit isomeer reageert met adenosine monofosfaat tot isopentenyl adenosine-5’-fosfaat m.b.v. het isopentenyl AMP synthetase enzyme.

Dit product wordt verder verwerkt tot isopentenyl adenosine door afsplitsing van het fosfaat door een fosfatase en tot isopentenyl adenine door afsplitsing van de ribose groep.

Dit isopentenyl adenine kan omgevormd worden tot de drie meest voorkomende natuurlijke cytokinine vormen.

Andere pathways of lichte wijzigingen in het proces geven aanleiding tot andere cytokinine vormen.

De afbraak van cytokininen gebeurt grotendeels door het cytokinine oxidase enzyme.  Dit enzym verwijdert de zijketen  zodat het adenine vrijkomt.  Ook derivaten kunnen op natuurlijke wijze worden gemaakt maar de pathways zijn zeer complex en nog niet helemaal doorgrond.

Naast de vrije vormen van de cytokininen komen vaak ook de ribosiden en de glucosiden voor.  Bij de glucosiden is de glucosegroep vaak irreversibel gebonden op het cytokinine waardoor het zijn werking verliest.  Ribosiden zijn beter opneembaar uit het medium en beter transporteerbaar dan het corresponderende vrije cytokinine.

2.2.3. Functies

De respons van een plant op een bepaald cytokinine hangt af van het type cytokinine en van de plantensoort.  Alhoewel niet alles geweten is over de werking worden volgende functies aan cytokininen toegeschreven:

Stimulatie van de celdeling

Stimulatie van de morfogenese in weefselculturen: scheut initiatie en knopvorming

Stimulatie van de uitgroei van zijscheuten, opheffen van dominantie van de eindknop

Stimulatie van de bladgroei door celstrekking

Bevorderen van de omvorming van etioplasten in cloroplasten door de stimulatie van de chlorofyl synthese

Preventie van senescentie

Bevordering van het openen van de huidmondjes in sommige plantensoorten

Inhibitie van embryogenese bij monocotylen

Inhibitie van de wortelvorming

remmen van de scheutstrekking

2.3. Interacties

2.3.1. Inleiding

De groei en ontwikkeling van een plant wordt gestuurd door de interactie en de verhouding tussen de verschillende groeiregulatoren.  Zo kunnen er antagonistische (ze werken elkaar tegen), additieve (de combinatie van 2 regulatoren geeft ongeveer het effect van de som van de effecten van elk afzonderlijk) of synergistische (2 regulatoren werken samen veel sterker dan de som van elk afzonderlijk) effecten optreden.  De celcyclusgenen zijn kandidaten om een rol te spelen in de bemiddeling van de effecten van verschillende groeiregulatoren (Shaul et al., 1996).  Samen vormen deze een zeer complex systeem waarvan lang nog niets alles begrepen wordt.

2.3.2. Auxinen

Zonder auxinen en cytokininen kan een plant niet ontwikkelen, er zijn dan ook nog geen auxine of cytokinine-deficiënte planten gevonden.  Ze zijn steeds en overal aanwezig en noodzakelijk in diverse ontwikkelingsprocessen.  De meristeemvorming in weefselculturen wordt geregeld door de cytokinine/auxine verhouding.  Wanneer de verhouding groter is dan één worden scheuten geïnitieerd.  Een ratio gelijk aan één leidt tot de vorming van ongedifferentieerd callus.  Is de ratio kleiner dan één dan wordt de wortelaanleg gestimuleerd.  Ook de apicale dominantie wordt door de cytokinine/auxine verhouding geregeld (Brzobohaty et al., 1994).  De auxinen kunnen ook voor de regeling van het cytokinine niveau binnen de plantenweefsels zorgen.  Dit door middel van de inhibitie van de cytokininebiosynthese en/of door inactivatie van het cytokinine door degradatie met cytokinineoxidasen of door N-glucosilatie (Palni et al., 1988; Kaminek et al., 1997).  Ook bij intacte planten regelt auxine de cytokinine hoeveelheid (Kaminek et al., 1997).

2.3.3. Ethyleen

Ethyleen inhibeert de wortelgroei.  De ethyleenproductie wordt gestimuleerd door zowel auxine als cytokinine.  Dit gebeurt heel dikwijls op een synergistische manier (Yu et al., 1981).  Door de complexe interactie tussen de verschillende plantenregulatoren is het moeilijk om de effecten van de verschillende regulatoren, zoals auxine-cytokinine-ethyleen van elkaar te onderscheiden (Yang en Hoffman, 1984).

De interactie tussen cytokininen, zowel natuurlijke als synthetische, en ethyleen leidt tot de inhibitie van de wortelgroei (Stenlid, 1982; Cary et al., 1995; Auer, 1995; Auer, 1997; Brault en Maldiney, 1999).  Ondanks het feit dat de worteltoppen een hoog gehalte aan endogene cytokininen bevatten (Short en Torrey, 1972) zijn deze componenten niet betrokken in de regulatie van de wortelelongatie ( Torrey, 1976).  Aan de toevoeging van exogene cytokininen worden echter enkele fenomenen toegeschreven:

·        ze lijken betrokken te zijn in de wortelinhibitie bij verschillende planten (Stenlid, 1982)

·        inhibitie van de wortelelongatie

·        ze stimuleren de wortelgroei van sommige planten, doch dit bij heel lage concentraties, bij wortels gevormd in weefselculturen (Lee, 1959; Nandi et al., 1977)

·        toename van de worteldiameter, te wijten aan de expansie van de cortexcellen (Svensson, 1972; Kappler en Kristen, 1986; Bertell et al., 1990)

Omdat de cytokininen gekend zijn omwille van hun stimulering van de ethyleenproductie (Fuchs en Lieberman, 1968; Radin en Loomis, 1969) kunnen sommige van deze effecten door ethyleen overgebracht worden (Stenlid, 1982).  Onlangs werd het mechanisme van ethyleeninductie door cytokinine blootgelegd met behulp van cytokinine ongevoelige mutanten (Cin mutanten).  Deze mutanten bezitten niet langer de mogelijkheid om de aanwezigheid van cytokininen te signaleren aan de ethyleenbiosynthese (Vogel et al., 1998).

Er is reeds geweten dat cytokininen de omzetting van S-adenosylmethionine (SAM) naar 1-amino-cyclopropaan-1-carbonzuur (ACC) stimuleren (Fig. 2.1.).  Dit ACC wordt uiteindelijk omgezet naar ethyleen.  Aangezien door ethyleeninhibitoren geen volledige opheffing van de effecten wordt bekomen rijst de vraag of misschien niet meer dan één systeem bij de wortelinhibitie betrokken is (Cary et al., 1995).

Figuur 2.1. Ethyleenbiosynthese

Verder bestaat er ook een gerelateerd effect dat al dan niet leidt tot de senescentie van bloemen (Whitehead et al., 1984; Reid, 1995; Taverner et al., 1999).  Bij Petunia leidt toediening van cytokinine tot het tegengaan van de senescentie terwijl het bij Rosa net senescentie induceert (Mayak et al., 1972;Taverner, 1999).