Hoofdstuk 1:  In vitro

1.1. Algemeen

Onder in vitro cultuur of plantenweefselteelt verstaat men het kweken of telen van plantendelen zoals geïsoleerde organen, weefsels, embryo’s, zaden, vruchtbeginsels, meeldraden, cellen en zelfs protoplasten, op een kunstmatig samengestelde voedingsbodem en dit onder gecontroleerde en steriele omstandigheden (Pierik, 1985).  De term in vitro wees op een teelt in glazen recipiënten, nu worden ook plastiek recipiënten gebruikt.

In tegenstelling tot de in vivo plant, die zijn voedingsstoffen uit de bodem absorbeert, heeft de in vitro plant naast de gebruikelijke bestanddelen als water en mineralen, ook chemische bestanddelen nodig voor een optimale groei.  Onder deze chemische bestanddelen bevinden zich ook de plantengroeiregulatoren.  Onder normale omstandigheden worden ze in uiterst kleine concentraties (nmol) door de plant zelf geproduceerd en getransporteerd naar de plantendelen waar ze voor hun effect zorgen soms hebben ze echter ook ter plaatse een specifieke werking.  Onder in vitro omstandigheden is het in 85% van de gevallen nodig om planten­groeiregulatoren aan het medium toe te voegen.

De 7 soorten plantengroeiregulatoren kunnen opgesplitst worden in 3 groepen, de groeiremmende (abscisinezuur en ethyleen), de groeistimulerende (auxine, cytokinine, brassinosteroïden en gibberelline) en de plantengroeiregulatoren die worden geproduceerd als respons op ernstige stress (jasmoninezuur en salicylzuur) (Werbrouck, 2001).  Veel effecten van deze componenten zijn na jaren onderzoek al gekend, maar men is er nog niet in geslaagd om alles volledig uit te diepen.

1.2. Historiek

Het telen en vermeerderen van plantenmateriaal op kunstmatig samengestelde voedingsmedia en onder gecontroleerde omstandigheden heeft al een lange weg achter de rug. Het grote succes van deze techniek rust op twee eigenschappen van de plant: plasticiteit en totipotentie.  De plasticiteit staat voor het grote aanpassingsvermogen van plantencellen in zeer wisselende omstandigheden.  Totipotentie stelt dat uit elke plantencel een volledig nieuwe plant kan bekomen worden.

 De basis werd in 1838 gelegd door Schwann en Schleiden met hun weltheorie.  Deze theorie zegt dat cellen autonoom en totipotent zijn.  In 1902 mislukten de eerste proeven om planten op voedingsbodems te kweken van Haberlandt omdat zijn voedingsmedium op veel vlakken tekort schoot.  Als eersten slaagden Robins, Kott en Molliard in 1922 om plantenweefsel in vitro te laten groeien.  In 1934 werden auxines geïsoleerd waardoor voor het eerst plantenhormonen ter beschikking van de plantenweefselteelt kwamen.  De volgende mijlpaal werd bereikt in 1939 toen Gutheret en Nobecourt erin slaagden om calluscellen onbeperkt te laten delen en gedurende een langere periode te laten groeien.

 In 1955 werd het cytokinine kinetine ontdekt waardoor weer een grote stap voorwaarts werd gezet.  De uiteindelijke doorbraak en de commercialisering van de in vitro techniek kwam in 1962 toen Murashige en Skoog het nu algemeen gebruikte MS-medium ontwikkelden (zie Appendix A).  In 1970 werden de eerste commerciële in vitro laboratoriums geopend.  Anno 2002 zoekt men nog steeds verder om de in vitro techniek en dan specifiek de groeiomstandigheden en de media te optimaliseren.

1.3. Invloedsfactoren

Een viertal factoren heeft invloed op het slaagpercentage van de techniek:

·        de kwaliteit en de aard van het uitgangsmateriaal

·        de samenstelling van het voedingsmedium

·        de algemene cultuuromstandigheden

·        de aseptische omstandigheden

1.3.1. Het uitgangsmateriaal

De moederplant moet een eliteplant zijn d.w.z. vrij van pathogenen en opgegroeid onder hygiënische omstandigheden om latere problemen met contaminanten te vermijden.  De voorbereidingsfase, stadium 0 genoemd, duurt minstens drie maanden:

·        de planten groeien beschut op in een serre

·        de temperatuur is relatief hoog (25 °C)

·        de relatieve vochtigheid is ongeveer 70 %

·        de planten krijgen nooit water over de kop, de watergift gebeurt via druppelirrigatie of capillaire opzuiging

De keuze van het explantaat bepaalt in belangrijke mate het succes van de in vitro teelt.  Deze wordt beïnvloed door de competentie en de besmettingsgraad van haar cellen.  Hierbij mag men stellen dat:

·        ondergrondse delen doorgaans meer organismen bevatten dan bovengrondse delen

·        inwendige weefsels gewoonlijk minder gecontamineerd zijn dan uitwendige weefsels

·        hoe kleiner het explantaat, hoe kleiner de kans op besmetting, maar ook hoe kleiner de overlevingskans

·        jonge weefsels minder gecontamineerd zijn dan oudere weefsels

1.3.2. Samenstelling van het voedingsmedium

Naast de goede kwaliteit van het uitgangsmateriaal is de samenstelling van het medium van groot belang.  Voor een optimale groei dient het medium perfect afgestemd te zijn op de noden van de plant.  Een voedingsmedium is opgebouwd uit een aantal essentiële factoren: anorganische zouten, spoorelementen, een suiker als koolstof- en energiebron en vitamines, al dan niet aangevuld met enkele bijkomende bestanddelen zoals plantengroeiregulatoren, organische stikstof, organische zuren en complexe substanties.  Meestal voldoet het Murashige & Skoog medium (MS-medium), soms is het echter nodig om op een ander medium zoals het Woody plant medium (WPM-medium) over te schakelen (zie Appendix A).

Meestal wordt gebruik gemaakt van vaste media.  Hierbij moet extra aandacht besteed worden aan de gebruikte agar.  De kwaliteit van de agar kan een effect hebben op regeneratieprocessen.  Hierbij is regeneratie van wortels en scheuten het gevoeligst.  Een goede of een slechte kan niet aangeduid worden.  Elke plantengroep heeft zijn eisen, de ene agar is misschien goed voor die groep maar voldoet dan niet voor een andere groep (Scholten en Pierik, 1998).  Ook moet men rekening houden met het feit dat de kwaliteit van de agar geen constant gegeven is.

1.3.3. Algemene cultuuromstandigheden

1.3.3.1. Water

Voor de in vitro cultuur van planten dient water extreem zuiver te zijn.  Niet alleen om schadelijke onzuiverheden te vermijden maar ook om de reproduceerbaarheid van de gebruikte media te verzekeren.

1.3.3.2. pH

De pH van een medium beïnvloedt de opname van heel wat componenten en reguleert heel wat biochemische reacties.  De pH wordt ingesteld met behulp van KOH of HCl voor de meeste media.  Het autoklaveren zorgt voor een daling van enkele tienden.  Tijdens de cultuur verandert de pH door de selectieve opname en uitwisseling van ionen door de plant.

1.3.3.4. Klimatisering

In de meeste gevallen is licht noodzakelijk voor in vitro vermeerdering.  De fotoperiode, de intensiteit en het spectrum zijn belangrijke karakteristieken.  Een veel gebruikt lichtregime is 16 uur licht / 8 uur donker met een lichtintensiteit van
40 μmol m^-²s^-1 PAR (“Photosynthetic Active Radiation”).  Om te verhinderen dat de temperatuur te hoog zou oplopen is het nodig dat de lucht continu gekoeld en homogeen over de groeikamer verdeeld wordt.

Door het serre-effect zal de temperatuur in de recipiënten meestal 5 °C hoger zijn dan de temperatuur van de groeikamer.  Ook zal de bodem van de recipiënten warmer zijn dan de top wat bijdraagt tot een hogere relatieve vochtigheid in de bokalen wat mogelijk tot hyperhydriciteit kan leiden.  Om dit te beperken kan men gebruik maken van bodemkoeling.

1.3.4. Aseptische omstandigheden

1.3.4.1. Autoclaaf

De autoclaaf is een onmisbaar element van elk in vitro labo.  De autoclaaf maakt gebruik van het principe van de hoge drukpan om het kookpunt van vloeistoffen te verhogen.  Typische werkwaarden zijn 121 °C bij 1 atm overdruk gedurende 15 tot 20 minuten voor volumes kleiner of gelijk aan 1 liter.  Bij deze waarden steriliseert de stoom heel efficiënt.

1.3.4.2. Laminar airflow cabinet (l.a.f.)

De meest effectieve manier om besmetting van een open container te voorkomen is er bacteriologisch zuivere lucht over te laten stromen.  In de plantenweefselteelt worden hiervoor horizontale laminaire airflow kabinetten gebruikt.  De lucht gaat eerst over een voorfilter waarna het door een HEPA – filter (High Efficiency Particulate Air) gestuurd wordt.  Deze filter uit glasvezel houdt alles groter dan
0,3 μm tegen.  De gezuiverde lucht stroomt in laagjes over de afgesloten werktafel waardoor micro-organismen niet kunnen binnendringen.

1.4. Voor en nadelen (Debergh, 1997)

1.      Soms is de in vitro cultuur niet te vergelijken met de in vivo cultuur; in vitro zijn realisaties mogelijk die in vivo niet realiseerbaar zijn.

2.      Soms bezitten de in vitro planten nadien niet meer het vermogen om wortels te vormen.

3.      Er is steeds een grote kans dat mutaties optreden.

4.      Niet alle planten overleven de snijwonden.

5.      Men heeft heel wat gespecialiseerd materiaal nodig wat resulteert in een grote investeringskost.

6.      Geschoold personeel is niet altijd even gemakkelijk te vinden.

7.      Er bestaan nog heel wat problemen die dringend om een oplossing vragen.

8.      De procedure neemt minder plaats in beslag ten opzichte van de klassieke vermeerdering.

1.5. Problemen bij in vitro culturen

Bij in vitro culturen komen nog heel wat problemen voor.  We beperken ons hier tot de bij de proeven voorkomende problemen.

1.5.1. Besmettingen

De besmettingen van de in vitro culturen worden veroorzaakt door virussen, schimmels, gisten en bacteriën.

Een van de grote problemen bij in vitro teelten zijn virussen en inwendig voorkomende bacteriën.  Deze komen vaak pas na een aantal subculturen tot uiting en hierdoor is dan meestal een groot deel van de stock aangetast.

1.5.2. Mijten en thrips

Mijten behoren tot de spinachtigen die zich voeden met schimmels en de sporen ervan verspreiden via hun uitwerpselen.  Een wijfje baart een duizendtal jonge mijten die te voet migreren van het ene recipiënt naar het ander.

Thrips is een vliegend insect. De nimfen kruipen na het ontluiken uit de recipiënten en laten zich vallen om zich vervolgens te verspreiden over de andere culturen.

Om de culturen te beschermen worden de legplanken preventief met een butyllijm ingestreken.

1.5.3. Hyperhydriciteit

De infiltratie van water in de intercellulaire holtes waardoor de planten een glasachtig en bros uitzicht krijgen wordt bij micropropagatie als zeer schadelijk ervaren.  De eerste wetenschappers die het probleem identificeerden waren Grout en Crisp (1978).  Debergh et al. waren in 1981 de eersten die de term vitrificatie introduceerden.  Toen deze term later al in de fysica gebruikt bleek voor de omzetting van substanties in glas of een gelijkaardige amorfe substantie door warmte en fusie, werd algemeen overgeschakeld op de nieuwe term hyperhydriciteit (Debergh et al.,1992).

De planten vertonen niet altijd even duidelijke symptomen.  Soms is het zeer moeilijk om deze te herkennen, alleen al omwille van het feit dat ze pas na geruime tijd zichtbaar worden.  Hyperhydriciteit kan omschreven worden als anatomische, fysiologische en biochemische anomalieën bij weefselculturen (Fig. 1.1.).  Deze worden voornamelijk waargenomen in de bladeren.  De symptomen in stengel en wortels zijn zeer moeilijk te herkennen.

Verschillende ingrepen laten toe hyperhydriciteit te vermijden, maar meestal zijn er naast dit voordeel ook nadelen:

·        verhogen van de agarconcentratie " een hogere kostprijs, een verlaagde vermenigvuldigingscoëfficiënt

·        verlaagde cytokinineconcentratie of gebruik maken van zwakkere cytokininen " een verlaagde vermenigvuldigingscoëfficiënt

·        vast in plaats van vloeibaar medium " een hogere kostprijs

·        betere verluchting van de container " uitdroging van het medium, zoutschade

·        bodemkoeling " tragere groei

·        verhoogde lichtintensiteit " een hogere kostprijs

Figuur 1.1. Voorbeeld van hyperhydriciteit bij Oreopanax nymphaefolia

1.5.4. Ethyleen

Door de aanwezigheid van cytokininen in het medium en door de beschadigingen aan de plant bij het versnijden en plaatsen in het medium produceert de plant hoge dosissen ethyleen.  Hierdoor zorgt ze dus gedeeltelijk voor haar eigen destructie.  Dit uit zich in het bruin verkleuren van de bladeren en het uiteindelijk afsterven van de volledige plant.  Om dit proces tegen te gaan is het noodzakelijk om de planten regelmatig over te enten en te zorgen voor een goede ethyleen uitwisseling van de recipiënt met de omringende atmosfeer zonder hierbij te grote risico’s te nemen i.v.m. de steriliteit.  Het blijft dus zoeken naar cytokininen die niet voor deze destructie zorgen.

1.5.5. Winterrust

Een veel voorkomend probleem bij houtige gewassen is dat deze ook onder in vitro omstandigheden toch nog hun natuurlijk bioritme aanhouden.  Dit wil zeggen dat de scheuten tijdens de wintermaanden in rust gaan en deels verhouten.  Dit op zich ware geen echt probleem ware het niet dat deze rustperiode voor sommige planten definitief is.  Bij zaden is het verschijnsel van dormantie beter gekend maar toch is er nog geen universeel toepasbare methode ontwikkeld om dit op te heffen.  De winterrust wordt grotendeels geregeld door de concentratie abscisinezuur.  Gibberellinen lenen zich goed om deze periode in te korten of zelfs volledig te overbruggen.  Er is echter tot op vandaag weinig geweten hoe deze beide regulatoren met elkaar interageren en hoe ze het uitlopen van knoppen en kiemen van zaden beïnvloeden.

1.5.6. Bruinverkleuring (Werbrouck, 2001)

Een natuurlijke afweermechanisme van planten op een invasie van schimmels of bacteriën is de productie van (poly)fenolische verbindingen zoals lignine en fytoalexinen, deze verhinderen of hinderen de groei van deze parasieten.  Ook de synthese van een bijzondere groep polyfenolen, namelijk de auxineprotectoren, wordt gestimuleerd.  Deze protectoren verhinderen de door de peroxidase gekatalyseerde oxidatie van indolazijnzuur (IAA) waardoor de celdeling toeneemt.  Onder in vitro omstandigheden wordt het plantenmateriaal mechanisch beschadigd.  De gebroken cellen verliezen hun inhoud en de omliggende cellen reageren hierop met de synthese van de hiervoor vernoemde polyfenolen.  Dit zijn meestal labiele verbindingen die gemakkelijk geoxideerd worden.  Deze oxidatieproducten zijn dikwijls fytotoxisch en kunnen bovendien zelf sterke oxidantia worden waardoor de oxidatiereacties nog versnellen.  Het weefsel kan hierdoor afsterven en/of er kunnen bruine stoffen uitlekken die na verdere oxidaties de plant langzaam vergiftigen.  Er zijn verschillende methodes om de vorming en de oxidatie van polyfenolen en de bruinverkleuring te vertragen:

regelmatig overenten op nieuw medium

toevoegen van antioxidantia aan het medium

eliminatie van enzymen en co-enzymen uit het medium

mangaan is een co-factor van peroxidasen, zonder mangaan kunnen bepaalde afbraakreacties niet doorgaan

koper is een co-factor van fenolase, dit is het voornaamste enzyme dat zorgt voor de oxidatie van endogene fenolen

inhibitie van de biosynthese van fenolen:

Cycloheximide is een inhibitor van fenylalanine amoniumlyase, één van de sleutelenzymen in de synthese van polyfenolen, het blokkeert echter ook heel wat andere celfuncties.

vertragen van de oxidatiereacties:

Door de omgevingstemperatuur te verlagen vertragen de oxidatiereacties.  Ook de afwezigheid van licht werkt gunstig.  Beide hebben ze echter een negatieve invloed op de groeisnelheid.